Альфа-фетопротеин (АФП) – доминирующий белок эмбриональной сыворотки млекопитающих, уровень которого снижается до следовых количеств в крови взрослых особей, но вновь поднимается в случае развития гепатоцеллюлярного рака (ГЦР) или тератобластом (ТБ) яичка или яичника. В связи с этим АФП широко используется в первичной дифференциальной диагностике этих опухолей, а также для оценки эффективности их лечения.
Впервые АФП был обнаружен в 1957 г. С. Bergstrand и В. Czar [22]. Его продукцию ГЦР мы описали на экспериментальных моделях [9], а затем Ю. С. Татаринов у человека [6]. Ассоциацию АФП с ТБ мы впервые обнаружили в совместной работе с клиницистами [10].
В нормальном развитии АФП синтезируется висцеральной энтодермой желточного мешка (ВЭЖМ) и фетальной печенью, а в организме носителя опухоли – их злокачественными аналогами ТБ (с элементами ВЭЖМ) и ГЦР.
В группе высокого риска по ГЦР АФП может служить хорошим серологическим маркером для ранней диагностики этой опухоли.
Повышенный уровень АФП в крови беременных – диагностический признак врожденной патологии, главным образом дефектов нервной трубки, пониженный уровень – маркер высокого риска по болезни Дауна.
АФП широко используется в онкологической клинике и в акушерстве. Он является превосходной системой для изучения регуляции тканеспецифических и эмбриоспецифических белков в нормальном развитии. Литература по этому белку включает несколько тысяч работ.
Структура и функция АФП
АФП состоит из 1 полипептидной цепи длиной 600 аминокислот с мол. массой 69 000 Д [66, 81] и углеводной частью, составляющей около 4%. Гаплоидный геном у млекопитающих содержит лишь 1 копию гена АФП. Однако сам АФП обладает четко выраженной микрогетерогенностью, обусловленной главным образом различиями в структуре углеводной части. Эта микрогетерогенность проявляется в различиях подфракций по нзоэлектрической точке и взаимодействию с лектинами.
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПАГ) в неденатурируюших условиях выявляет 2 четко разделяемые подфракции АФП, иммунологически идентичные [12], а изо-электрофокусирование в ПАГ – 6 подфракций с различной изоэлектрической точкой. Различия подфракций почти полностью снимаются обработкой нейраминидазой. Некоторый «вклад» в создание микрогетерогенности АФП вносится низкомолекулярными лигандами, главным образом полиненасыщенными жирными кислотами, прочно связывающимися с АФП, что мы специально рассмотрим ниже [59].
Имеются данные о существовании нескольких фракций мРНК АФП, обнаруженных в фетальной и «взрослой» печени и кодирующих фрагменты полипептидной цепи АФП с мол. массой 44 и 58 кД. Эта мРНК транслировалась в бесклеточной системе с образованием фрагментов полипептидной цепи АФП, преципитируемых антителами к АФП [58, 97]. Однако существование таких вариантов АФП в ощутимых количествах in vivo крайне маловероятно, поскольку во множестве иммуногистохимических исследований нормальной печени у взрослых животных АФП никогда не выявлялся, равно как никогда не обнаруживался с помощью антител в экстрактах печени.
Микрогетерогенность АФП играет важную роль в функциях АФП и используется и в диагностических целях. Так, было показано, что АФП, синтезируемый в фетальной печени и ГЦР, четко отличается по реакции с конканавалином А (КонА) от АФП, продуцируемого ВЭЖМ [87]. Более того, установлено, что АФП, обнаруживаемый в крови при активном хроническом гепатите, отличается от АФП, продуцируемого ГЦР, по реактивности с лектином из Lens Culinaris [86].
В последнее десятилетие предложено несколько методов для качественной и количественной оценки взаимодействия АФП с лектинами. Одна группа методов основана на фракционировании АФП на иммобилизованных лектинах [86, 87], другая – на аффинном электрофорезе АФП в присутствии лектина с последующим иммунным выявлением связанного и свободного АФП [25, 88].
Важно отметить, что профиль взаимодействия АФП с лектинами при беременности позволяет определить, составляет ли он фон или возникает в эмбрионе, имеющем дефект нервной трубки [88].
Наиболее важная особенность АФП, определяющая его функцию, это высокое сродство к полиненасыщенным жирным кислотам (ПНЖК), например, арахидоновой кислоте – предшественнику простагландинов и лейкотриенов [78]. Сродство АФП к ПНЖК выше на 5 порядков, чем соответствующий показатель сывороточного альбумина.
Поскольку предшественники ПНЖК не синтезируются в организме плода (и матери) и поступают в организм с пищей, вполне естественно предположить, что АФП транспортирует ПНЖК из кровотока матери в кровоток плода. Связывание ПНЖК может осуществляться в плаценте [48]. АФП, связавший ПНЖК, может взаимодействовать с рецепторами к нему и интернализироваться с последующей рециркуляцией. Рецепторы к АФП и их рециркуляция обнаружены в различных фетальных тканях [71, 93].
Пока не ясно, специфичны ли рецепторы АФП именно для этого белка или они взаимодействуют с АФП как лектины, обладая более или менее широкой специфичностью к различным гликопротеинам. В большинстве работ в качестве контроля на специфичность связывания АФП используется сывороточный альбумин, не являющийся гликопротеином.
Другая особенность АФП, родственная связыванию ПНЖК, – специфическое связывание эстрогенов [74]. Поскольку это свойство встречается только у АФП грызунов (крыса, мышь) и гораздо меньше выражено у АФП человека, оно обычно рассматривается как вторичное, имеющее физиологическое значение лишь у немногих видов. Существенно в связи с этим, что комплекс АФП – эстроген лишает эстроген-чувствительные ткани, такие как матка новорожденных мышей, чувствительности к свободному эстрогену [50]. В других случаях АФП был обнаружен на мезенхимных клетках мозга плода [7, 18]. На основании этих данных можно предположить, что у грызунов АФП служит эстрогеннейтрализующим белком на ранних стадиях развития плода и в этом состоит его вторая функция.
Наиболее противоречивы данные, относящиеся к третьей предполагаемой функции АФП – иммуносупрессорной. Впервые она была обнаружена еще в 1973 и 1975 гг. [67, 68, 77] in vitro и не подтверждена в многочисленных публикациях. Эффект, как было показано, зависел от источника АФП и способа его получения. Наиболее вероятно, что эффект определялся каким-либо лигандом (ПНЖК?), связанным с определенной подфракцией АФП [52].
Более четкими и перспективными представляются данные по подавлению под влиянием АФП экспрессии так называемого la-белка на мембране макрофагов [60, 61]. 1a-белок – продукт главного локуса гистосовместимости (ГКГ) II класса, образуя комплекс с фрагментами антигена, «представляет» (презентирует) их Т-клеткам-хелперам и запускает тем самым реакции специфического иммунитета. АФП, присутствуя в среде, подавляет экспрессию la-белка и, следовательно, препятствует начальному акту иммунного распознавания. Более того, контакт непроцессированного в макрофагах антигена с Т-клетками стимулирует образование специфических Т-супрессоров и ведет к выработке толерантности, т. е. специфической иммунной ареактивности на данный антиген. Таким образом, АФП может служить одновременно и физиологическим иммунодепрессантом в период внутриутробного развития, и фактором, способствующем выработке толерантности к собственным антигенам [61].
В заключение мы хотели бы подчеркнуть, что уникальным свойством АФП является связывание ПНЖК. Вполне возможно, что такие физиологические активности АФП, как транспортная, способность проникать внутрь клетки и иммуносупрессорная активность, так или иначе определяются связыванием ПНЖК.
Регуляция АФП: клеточный уровень
АФП в эмбрионе образуется в первых очагах кроветворения – ВЭЖМ и фетальной печени.
Желточный мешок. ВЭЖМ – первая дифференцировка эмбриона, а АФП – ее главный дифференцировочный маркер (тканеспецифичный белок) вместе с сывороточным альбумином, α1-антитрипсином и трансферрином, образуемыми в значительно меньших количествах [40]. Индукция ВЭЖМ в эмбриональных клеточных массах была тщательно изучена на модели эмбриональной карциномы (ЭК), сохранившей способность образовывать ВЭЖМ в ответ на воздействие ретиноевой кислотой (РК) – первым эмбриональным индуктором, действующим на самых ранних стадиях онтогенеза. Замечательной особенностью такой индукции является то, что она требует определенного положения клеток-мишеней в эмбрионе. Если РК действует на эмбриональные тельца, т. е. агрегаты поли- и эквипотентных клеток ЭК, то структура, аналогичная ВЭЖМ морфологически и биохимически, развивается только из клеток, расположенных во внешнем клеточном слое. Удаление внешнего слоя с помощью так называемой иммунохирургии, т. е. обработки соответствующей антисывороткой, ведет к включению в дифференцировку клеток подлежащего слоя [31]. Установлено также, что АФП образуется в этих условиях лишь в том случае, если индукция РК приводит к образованию морфологически обособленного ВЭЖМ. Если все биохимические события вслед за действием РК развиваются, но энтодерма не образуется, то АФП не синтезируется [80]. Это первое четкое указание на то, что межклеточные взаимодействия или взаимодействие клетки с внеклеточным матриксом необходимо для экспрессии гена АФП в ВЭЖМ.
Другое указание на важную роль межклеточных взаимодействий получено в экспериментах, где контакт ВЭЖМ с экстраэмбриональной эктодермой in vivo или in vitro ведет к обратимой репрессии синтеза АФП [30].
Таким образом, при первом появлении АФП в онтогенезе мы впервые встречаемся с межклеточными взаимодействиями как фактором, участвующим в регуляции синтеза АФП [42].
Профиль синтеза сывороточных белков на ранних стадиях развития, до включения печени в этот процесс, полностью определяется активностью ВЭЖМ. Доминирующим компонентом эмбриональной сыворотки в этот период является АФП, <тогда> как альбумин и трансферрин присутствуют в существенно меньших количествах.
Первичная кишка, образуемая как впячивание ВЭЖМ, сохраняет способность к синтезу АФП, но приблизительно в 100 раз более низкую. Эту способность можно выявить с помощью высокочувствительной реакции иммуноавторадиографии [41] или норзерн-блоттинга по присутствию мРНК АФП [92].
Фетальная печень. Печеночная почка формируется как вырост первичной кишки, онтогенетически тесно связанный с ВЭЖМ. Фетальная печень состоит из тяжей эпителиальных клеток, расположенных в тесном контакте с островками кроветворных клеток. Все (или практически все) фетальные гепатоциты в этот период синтезируют и секретируют АФП наряду с сывороточным альбумином, α1-антитрипсином и трансферрином. Иммуноэлектронная микроскопия АФП на этой стадии развития показала специфическую адсорбцию на мембране эритробластов, сопровождающуюся интернализацией [20].
Со временем состав фетальной сыворотки крови постепенно изменяется с преобладанием альбумина и непрерывным возрастанием его концентрации. Альбумин становится доминирующим белком фетальной сыворотки, несмотря на то, что скорость синтеза АФП при образовании печени тоже возрастает.
Многое остается загадочным в формировании закладки печени – факторы, ее индуцирующие, равно как и факторы, определяющие резкую активацию синтеза АФП в печени по сравнению с первичной кишкой. Правда, здесь ситуация начинает уже проясняться по мере идентификации трансфакторов, регулирующих активность гена АФП (см. ниже).
Морфогенетические потенции клеток печени на ранней стадии ее развития также еще не вполне ясны. Наиболее вероятно, что они являются бипотенциальными, способными дифференцироваться в гепатоциты и клетки эпителия желчных протоков – холангиоциты [62]. На следующей стадии обе линии дифференцировки разделяются, образуя печеночные балки и желчные протоки. Холангиоциты утрачивают способность к синтезу АФП, а гепатоциты продолжают его образовывать с максимальной интенсивностью вместе с другими специфичными для печени сывороточными белками. Следует подчеркнуть, что у мыши все гепатоциты синтезируют АФП, что было установлено иммуногистохимически и методом обратного локального гемолиза в геле [15]. В этих же исследованиях была показана и полифункциональность гепатоцитов по крайней мере по отношению к синтезу АФП и сывороточного альбумина.
Нет никаких данных о том, что экспрессия АФП-гена в фетальной печени может регулироваться какими-либо эндогенными факторами. Более вероятно, что этот ген работает как конститутивный тканеспецифический ген с максимальной и физиологически нерегулируемой экспрессией.
Следует подчеркнуть, что приведенные характеристики экспрессии гена АФП справедливы для мышей и крыс с их коротким периодом беременности. В онтогенезе же человека резкая гетерогенность гепатоцитов по продукции АФП имеет место уже в начале второго триместра, когда наступает перелом в кривой содержания АФП в циркуляции.
В заключении этого раздела, следует отметить, что бипотенциальные клетки фетальной печени, по-видимому, не исчезают в дальнейшем развитии, но сохраняются во взрослом органе в качестве стволовых клеток, локализованных в мельчайших желчных протоках и практически неопределяемых в нормальных условиях.
Постнатальная печень. Драматические изменения в структуре печени наступают в раннем постнатальном периоде у мышей и крыс. Кроветворная функция печени прекращается, и эритробласты исчезают из ее ткани. Паренхимные клетки печени, образующие ацинарные структуры, перестраиваются в печеночные балки. В процессе этой перестройки гепатоциты перестраивают свою мембрану, на которой теперь можно четко выделить 2 района – апикальный, ограничивающий желчный капилляр, и базальный, «открытый» в синусное пространство. Каждый район имеет свои характерные антигенные маркеры. Так, антиген желчных капилляров (АЖК) локализуется в зрелом гепатоците строго на апикальном конце, рецептор к асиалогликопротеиду (РАс) строго маркирует базальный район. Контрастную локализацию имеет так называемый антиген II, равномерно расположенный по всей мембране гепатоцита [3]. Мы широко используем сочетание этих маркеров для характеристики дифференцировки гепатоцита.
Так, при переходе от ацинарной к балочной структуре в раннем постнатальном периоде видно, как АЖК, очерчивающий проток внутри ацинуса, становится собственно антигеном желчных капилляров, а базальный маркер, РАс, ограничивающий ацинус с внешней стороны, переходит к строго синусоидальной локализации. Процесс переупаковки гепатоцитов имеет градиентный характер – он начинается вблизи портального тракта и «перемещается» по направлению к центральной вене. Этот процесс коррелирует с угасанием синтеза АФП в постнатальной печени. Угасание идет в направлении от портального тракта к центральной вене. Последние АФП-содержащие клетки образуют «кольца» вокруг центральных вен и локализуются в клетках, приобретающих АЖК последними [15].
Здесь снова мы встречаемся с ситуацией, когда межклеточные или матрикс-клеточные взаимодействия, наиболее вероятно, контролируют процесс угасания синтеза АФП в печени, приобретающей дефинитивную структуру. Эти события соответствуют ранее высказанной нами гипотезе [13] о том, что «АФП+» или «АФП−» фенотип гепатоцита определяет его отношение к печеночной балке. Вхождение гепатоцита в структуру балки ведет к подавлению синтеза АФП, а выход из балки – к его реэкспрессии.
Система, где фетальная печень дифференцируется в соединительнотканном матриксе из свиной кожи [38], может быть очень полезной для анализа этой проблемы.
Печень взрослого. Зрелые гепатоциты печени взрослого не синтезируют АФП в обнаруживаемых количествах. В дефинитивной печени не обнаруживается и клеток другого типа, продуцирующих АФП. Выявление низкомолекулярных форм мРНК АФП В непаренхимных клетках «взрослой» печени [58] не сопровождается в них иммунологически обнаруживаемыми фрагментами АФП.
Однако фоновые (нанограммовые) уровни АФП в сыворотке взрослых особей говорят либо об очень низкой продукции АФП зрелыми гепатоцитами, либо о спорадической активации в них синтеза АФП при определенных условиях.
Главное, что доказано в отношении синтеза АФП в зрелом гепатоците, это обратимая репрессия его синтеза.
Действительно, синтез АФП может быть временно индуцирован при регенерации печени у взрослых мышей, молодых крыс и в меньшей степени у взрослых крыс [12]. Следует при этом подчеркнуть, что регенерация, вызванная удалением ⅔ печени, на порядок менее эффективна в индукции АФП, чем регенерация, вызванная отравлением примерно того же количества гепатоцитов четыреххлористым углеродом.
Это говорит в пользу того, что возобновление синтеза АФП не обусловлено пролиферативной активностью клеток печени, одинаковой в обоих случаях [65].
Иммуногисто- и иммуноцитохимическое исследование синтеза АФП при регенерации печени у мышей выявляет этот белок, по крайней мере преимущественно, в самих зрелых гепатоцнтах и внутриклеточных структурах, участвующих в синтезе и секреции белков. АФП-содержащие гепатоциты не отличаются морфологически или по плоидности или размеру от остальных гепатоцитов и не образуют особой гистогенетической субпопуляции в печени [33].
Более того, можно показать, что практически любой гепатоцит в дефинитивной печени может быть вовлечен в процесс «реиндукции» синтеза АФП независимо от степени его зрелости (плоидности), исходного положения в дольке и фазы клеточного цикла [34, 39].
Очень важны и до сих пор не понятны межвидовые и межлинейные различия в «индуцибельности» АФП у взрослых особей. Так, крысы, как правило, образуют АФП при регенерации печени на порядок меньше, чем мыши, а у людей возобновление АФП при регенерации печени еще ниже, чем у крыс. Разные линии мышей резко отличаются друг от друга по «реиндукции» АФП: наименее «индуцибельны» C57BL/6 и родственные линии при «высокоиндуцибельных» SWR и «супериндуцибельных» BALB/sJ [11, 33, 45]. Эта разница контролируется генетически [94].
На основании иммуногистохимических данных можно заключить, что критическим фактором для включения гепатоцита в синтез АФП является его топографическое положение относительно зоны некроза – воспаления, вызванного гепатотоксином в печеночной дольке [15, 42]. Содержащие АФП клетки локализовались, как правило, в первом ряду клеток, окружающих зону некроза – воспаления, независимо от положения некроза – центролобулярного или перипортального, его размеров и формы [15]. Даже единичный минимальный некроз – воспаление, вызванный надрезом края печеночной дольки, ведет к появлению перинекротического одноклеточного слоя АФП-положительных гепатоцитов [11]. Иммуно-электронно-микроскопическое исследование этих клеток выявило картину активного синтеза и секреции АФП, который локализуется в структурах шероховатого ретикулума, пери-нуклеарного пространства и в цистернах аппарата Гольджи [33].
Очень существенно, что такое минимальное повреждение находится ниже порога, необходимого для индукции регенераторного стимула для неповрежденной части печени. «Реиндукция» АФП в этих условиях происходит без регенерации печени, в клетках, даже не вступивших в клеточный цикл. Подобные эксперименты наиболее убедительно показывают, что синтез АФП может быть отделен от пролиферации гепатоцитов. Это положение противоречит общепринятому мнению о связи пролиферации гепатоцитов с синтезом АФП, основанному на очевидном совпадении этих процессов – синтезе АФП в фетальной, регенерирующей и малигнизированной печени.
Данные о локализации АФП-положительных клеток в перинекротической зоне послужили одним из оснований для гипотезы о том, что положение гепатоцита относительно печеночной балки является критическим фактором, контролирующим включение или выключение гена АФП [13].
Если это предположение справедливо, то лучшим «индуктором» синтеза АФП должна быть диссоциация печени на отдельные клетки при полном разрушении ее балочной структуры.
АФП в культуре гепатоцитов. Действительно, эксплантация изолированных из «взрослой» печени крысиных гепатоцитов в культуру ведет к слабому, но обнаруживаемому синтезу АФП [56, 85]. Синтез АФП интенсивнее в первичной культуре мышиных гепатоцитов [27]. Это наблюдение было многократно воспроизведено, и процессы усилены в нашей лаборатории А. С. Глейберманом [1]. Перфузия печени взрослой мыши раствором коллагеназы с последующей эксплантацией полученной клеточной суспензии в культуру приводили к «реиндукции» синтеза АФП на 3–4-й день культивирования с одновременной утратой синтеза сывороточного альбумина.
Реэкспрессия АФП не зависела от линии мышей, от которой были получены гепатоциты – печень C57BL/6 была столь же пригодна, как и BALB/cJ. Таким образом, генетический контроль «реиндукции» АФП, судя по этой системе, осуществляется не на внутриклеточном уровне, а скорее на уровне межклеточных или клеточно-матриксных взаимодействий.
Однако наиболее интересными в этой системе оказались возможности регуляции синтеза АФП in vitro.
Этот синтез оказался зависимым от плотности клеток в монослое. Если чашку медленно вращать сразу же после переноса в нее клеток, то они собираются в центре, образуя плотный монослой с «рыхлой» периферией. АФП появляется на периферии, образуя четкое АФП-положительное кольцо, сжимающееся со временем вокруг АФП-отрицательного центра [43,44].
Изучение межклеточных связей в таком монослое обнаружило четкую корреляцию между образованием межклеточных щелевых контактов и подавлением синтеза АФП in vitro [43, 44].
Те же соотношения более ярко проявлялись при культивировании клеток в трехмерном коллагеновом геле и в наибольшей степени при совместном культивировании гепатоцитов с непаренхимными клетками печени. В обоих случаях наблюдались островки органотипического роста, состоящие из кубоидальных полигональных гепатоцитов, образующих типичные желчные капилляры, «выстланные» АЖК, с четко выраженными синусоидальными доменами, экспрессирующими РАс. Внутриклеточное распределение актина, образующего как бы «подложку» вокруг желчного капилляра, было также типичным для зрелого дифференцированного гепатоцита. Синтез АФП в таких островках был полностью подавлен. В участках, где вследствие нарушения трехмерного геля или при низкой плотности непаренхимных клеток органотипический рост не устанавливался, наблюдалась активная реэкспрессия АФП [43, 44]. В самое последнее время А. С. Глейберман в нашей лаборатории показал, что культивация мышиных гепатоцитов в бессывороточной среде и в присутствии диметилсульфоксида и фенобарбитала ведет к образованию органотипических гепатоцитарных островков с экспрессией различных маркеров печеночной дифференцировки и с полным подавлением синтеза АФП [55].
Следует подчеркнуть, что изменения, наблюдаемые в гепатоцитах in vitro при возобновлении в них синтеза АФП,– утрата полярности, исчезновение АЖК, перераспределение актина и утрата межклеточных контактов наступают также и in vivo в перинекротическом слое клеток.
Таким образом, все данные, полученные на клеточном уровне при изучении, синтеза АФП, свидетельствуют об обратимости подавления синтеза АФП в зрелом гепатоците и о межклеточных (или матрикс-клеточных) взаимодействиях как критическом факторе в регуляции экспрессии гена АФП in vitro и in vivo в онтогенезе.
Генетический уровень регуляции синтеза АФП
Работы последнего десятилетия создали решающий прорыв в проблеме генетического контроля экспрессии гена АФП.
Ген АФП был клонирован и его первичная структура расшифрована. Ген АФП входит в суперсемейство, состоящее из 3 специфичных для печени генов: сывороточного альбумина, АФП и витамин D-связывающего белка [70]. Крысиный ген АФП, подобно гену сывороточного альбумина, представлен фрагментом ДНК протяженностью 15 тыс. осн., включающим 15 экзонов [см. 70], в то время как ген АФП человека имеет размер 19,5 тыс. осн. с теми же 15 экзонами. Первичная структура его расшифрована [39]. Регуляторный район АФП-гена расположен на его 5´ конце и занимает около 7 тыс. осн. Этот район включает проксимальный промотор с множественными участками связывания транскрипционных факторов (ТФ) и 2 дистальных энхансера [46, 47]. Промотор содержит регуляторные сайты, связывающие транскрипционные факторы, обеспечивающие тканеспецифическую экспрессию гена, равно как и транскрипционные факторы, ответственные за подавление активности АФП-гена.
Два дистальных энхансера усиливают эффект тканеспецифической экспрессии гена АФП. Это было показано с использованием преходящей и стабильной трансфекции с различными конструкциями, включающими фрагменты регуляторного района, конъюгированные с минигеном АФП или с САТ-репортерным геном [46, 47, 70, 76, 99].
В самые последние годы были достигнуты первые успехи в идентификации трансфакторов, регулирующих ген АФП. Идентифицировано несколько таких факторов. Некоторые из них являются общими для нескольких тканей (NF1), другие специфичны для печени или ВЭЖМ (HNF1 и с/ЕВР). Среди трансфакторов, обладающих супрессорной активностью, идентифицированы 3 – NPIII, NPIV и рецептор глюкокортикоидов. Эти факторы реагируют с различными районами промотора гена АФП и подавляют его транскрипцию.
Дифференциальное включение трансфакторов определяет различную интенсивность синтеза АФП на разных стадиях развития.
Трансфакторы являются связующим звеном между начальными стадиями дифференцировки в эмбрионе и активацией первых тканеспецифических генов в ВЭЖМ и печени. Вместе с тем трансфакторы связывают межклеточные или матрикс-клеточные взаимодействия с реализацией фенотипа клетки висцеральной эндодермы или гепатоцита.
Несомненно, что основной интерес в исследовании регуляции генов в онтогенезе смещается с изучения структуры их регуляторных районов в область идентификации соответствующих трансфакторов, причем модель регуляции АФП стала одной из излюбленных в этой области.
Что известно об участии трансфакторов в развитии? Как уже упоминалось выше, синтез АФП начинается в первой дифференцированной ткани эмбриона, ВЭЖМ, которая индуцируется РК. Каков путь от воздействия РК к экспрессии АФП? Показано, что РК-рецептор, активированный лигандом, индуцирует транскрипцию первого, регуляторного гена, принадлежащего семейству гомеозисных генов – Hom 1.6. Продукт этого гена индуцирует активность генов, контролирующих синтез белков матрикса, включая ламинин и коллаген IV типа. Продукция этих белков требуется для формирования базальной мембраны, которая в свою очередь необходима для развития ВЭЖМ. Транскрипция Hom 1.6 приводит также и к активации трансфактора, HNF-1, ответственного за экспрессию гена АФП (80]. Похоже, что в этой системе проявляется кратчайший путь, связывающий первичный эмбриональный индуктор (РК) через первичные регуляторные гены (семейства Hom) с образованием висцеральной эктодермы и синтезом специфичных для этой ткани регуляторных генов (HNF-1 и, вероятно, некоторых других).
Следует отметить, что HNF-1 содержит домен, родственный гомеодоменам, характерным для белков гомеозисного семейства.
Следующий этап – АФП в фетальной печени. Индукция печеночной почки и ее развитие в фетальную печень сопровождаются вовлечением в активацию гена АФП транскрипционных факторов – с/ЕВР, HNF-2, HNF-3 и NF-1; 3 первых транскрипционных фактора специфичны для печени, а последний является общим для нескольких тканей.
Все трансфакторы взаимодействуют с проксимальным промотором и, вероятно, с дистальными энхансерами [76, 99]. Они же активируют семейство генов, контролирующих синтез сывороточных белков в печени, – альбумина, витамин D-связывающего белка и α1-антитрипсина, в то время как трансферин, α2-макроглобулин и некоторые другие сывороточные белки относятся к другой регуляторной группе.
Чем определяется «включение» новых трансфакторов и «выключение» HNF-1 при формировании фетальной печени, полностью не известно.
Следующий этап – регуляция АФП в зрелых гепатоцитах характеризуется включением всех положительных трансфакторов, активность которых, однако, подавляется «отрицательными» трансфакторами NPIII, NPIV и «активированным» глюкокортикоидным рецептором, взаимодействующими с промотором и блокирующими транскрипцию гена АФП.
Описанное недавно наследственное сохранение высокого уровня АФП у взрослых людей может оказаться полезной системой для идентификации генетических элементов, ответственных за «выключение» гена АФП у человека [45].
Неизвестно, какие трансфакторы ответственны за смену фетального фенотипа гепатоцита на взрослый, происходящую в культуре тканей, т. е. при реализации межклеточных или матрикс-клеточных взаимодействий.
АФП в патологии
В этом разделе мы попытаемся рассмотреть поведение АФП при различной патологии в свете того, что известно о нем в экспериментальных системах. К сожалению, это возможно не во всех случаях.
Неопухолевые заболевания. У человека в 1-й год жизни уровень АФП подвержен столь сильным колебаниям, что временный подъем возможен даже при простуде [16]. Стабильное и регулярное повышение уровня АФП в детском возрасте наблюдается при тирозинемии [21] и атаксии – телеангиэктазии [95]. Задержка развития или нарушения структуры печени при этих состояниях скорее всего ответственны за сохранение высокого уровня АФП. Однако ничего более определенного в этих случаях не установлено.
Заболевание печени. Временное повышение уровня АФП, более резкое при остром вирусном гепатите и менее выраженное и волнообразное при циррозе печени [16], хорошо согласуется с экспериментальными данными по синтезу АФП при повреждении и регенерации печени у мышей и крыс. Уровень АФП при этой патологии поднимается приблизительно в 15% случаев и не превышает, как правило, 500 нг/мл. К сожалению, гистологическая локализация АФП при этой патологии почти не изучена и неизвестно, как расположены места синтеза АФП относительно некроза и воспаления в пораженной печени. Важно отметить, что АФП, синтезируемый неопухолевыми гепатоцитами, можно отличить от АФП, возникшего в ГЦР, по его взаимодействию с лектином Lens Culinaris (29, 86] или по степени фукозилирования. Это очень важно с практической точки зрения, поскольку дифференциальная диагностика ГЦР и цирроза печени при низких уровнях АФП (до 50 нг/мл) представляет большие трудности.
АФП при опухолях. Одно из общепринятых положений онкологии гласит, что опухоль сохраняет направление и уровень дифференцировки клетки-предшественницы. Это позволяет рассматривать совместно характеристики нормальных и соответствующих опухолевых тканей, продуцирующих АФП.
ЭК и опухоли желточного мешка (ОЖМ). ЭК и близкородственная ей опухоль тератокарцинома (ТК) представляют собой злокачественные гомологи эмбриональной ткани (ЭК) или эмбриональной ткани с элементами более или менее дифференцированных тканей (ТК). Предшественниками ЭК являются клетки зародышевого эпителия, чаще всего относящиеся к пре- или постмейотической стадии дифференцировки (между I и II мейотическим делением). Эти клетки относятся к стволовым, полипотентным эмбриональным клеткам, способным, как и их нормальные предшественники, к самой разнообразной дифференцировке [26]. Собственно ЭК состоят из аналогов эмбриональных клеток, в то время как ТК включают очаги дифференцировки в гомогенную ткань ЭК.
Только часть потомства стволовых клеток ЭК – всегда менее половины выходит в дифференцировку, остальные воспроизводятся на уровне материнских клеток.
Таким образом, стволовые клетки ЭК и ТК являются аналогами ранних эмбриональных клеток, способными к дифференцировке в различные зрелые ткани. Один из первых продуктов дифференцировки в эмбрионе, как уже говорилось выше, – ВЭЖМ. В процессе прогрессии опухоли может произойти дополнительная трансформация предшественника ВЭЖМ. В этом случае на основе ЭК или ТК возникает новая опухоль – ОЖМ, очаги дифференцировки в которой будут аналогами ВЭЖМ. Если новая опухоль опередит в скорости роста исходную, то она вытеснит свою предшественницу и будет существовать как «чистая» форма ОЖМ [26, 79, 90].
При действии эмбрионального индуктора РК на ЭК или ТК обычно возникают структуры, аналогичные ВЭЖМ. Структура, аналогичная ВЭЖМ, в ЭК или ТК сохраняет способность к синтезу сывороточных белков, включая прежде всего АФП. Это было очень убедительно показано иммуногистохимически [32], а также путем определения белков человеческой сыворотки, секретируемых ВЭЖМ внутрь эмбриоидных телец [32] или в кистозную жидкость при росте человеческой ОЖМ на мышах nude [72]. Следует отметить, что АФП является доминирующим компонентом среди сывороточных белков, синтезируемых нормальным или опухолевым ВЭЖМ. В обоих случаях профиль его связывания с лектинами характерен именно для эмбриональной формы АФП – очень низкое связывание с КонА, в отличие от АФП. печеночного происхождения, большая часть которого связывается с КонА [25, 87].
В редких случаях ТК образует АФП, характерный для печени. При этом в них обнаруживаются очаги дифференцировки типа фетальной печени [91].
В 80–90% случаев ЕК, ТК или ОЖМ сопровождаются повышенными уровнями АФП в крови, что высокоспецифично в дифференциальной диагностике этих опухолей с семиномами, дисгерминомами или стромальными опухолями яичка или яичника [14, 16]. Добавочный серологический маркер ЭК и ТК – хорионический гонадотропин, продуцируемый аналогами трофобласта, часто развивающимися в этих опухолях [24]. Определение обоих маркеров очень информативно и повсеместно используется как для первичной диагностики этих опухолей, так и для оценки эффективности их лечения. Указанные опухоли хорошо поддаются лечению при сочетании радикальной операции с последующей химиотерапией цис-платиной [28].
Другие опухоли яичка и яичников – семинома, опухоли стромальных клеток или клеток Сертоли всегда четко отрицательны по АФП [16]. Таким образом, АФП в сочетании с хорионическим гонадотропином практически строго специфичен для ЭК, ТК или ОЖМ как в диагностике, так и в мониторинге.
Гепатобластомы (ГБ). ГБ четко отличаются от ГЦР «взрослого» типа и являются характерными опухолями для детей младшего возраста [49, 51]. ГБ состоят из клеток, соответствующих по морфологии и физиологии фетальным гепатоцитам с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, выраженной базофилией и слабо развитым эндоплазматическим ретикулумом. Иногда ГБ содержат очаги гемопоэза и даже остеогенеза. В клиническом отношении ГБ менее злокачественны, чем ГЦР, и лучше поддаются хирургическому лечению [49,51].
Поскольку ГБ представляет собой «злокачественный аналог» фетальной печени, можно ожидать высокой продукции АФП. Действительно, эти опухоли сопровождаются АФП с самой высокой частотой (до 90% случаев) и с наивысшими уровнями АФП [16]. Более того, в иммуногистохимических исследованиях установлено, что большинство клеток ГБ содержат АФП.
Таким образом, АФП является превосходным сывороточным маркером ГБ человека как при ее первичной диагностике, так и при оценке эффективности лечения. Однако мышиная перевиваемая ГБ полностью лишена способности синтезировать АФП [53].
АФП и овальные клетки (ОК): регенерация печени и гепатоканцерогенез. Временное возобновление синтеза АФП происходит при регенерации печени и в острой фазе химического канцерогенеза в печени, вызванного почти всеми химическими канцерогенами, за исключением диэтилнитрозамина [55, 98].
Этот подъем уровня АФП тесно связан с появлением так называемых ОК [54], которые четко отличаются от гепатоцитов и клеток желчных протоков. ОК много мельче гепатоцитов, они имеют более высокое ядерно-цито-лазматическое отношение, ядро неправильной формы и плохо развитый шероховатый эндоплазматический ретикулум. ОК образуют железистые структуры, окруженные базаль-ными мембранами. АФП регулярно обнаруживается по крайней мере в части ОК, в которых он локализуется в местах внутриклеточного синтеза – эндоплазматическом ретикулуме и неядерной мембране [82, 85, 89].
Происхождение и судьба ОК, равно как и их роль в канцерогенезе, остаются в области предположений. Мы приведем здесь наиболее распространенную и вероятную концепцию о природе и происхождении ОК.
Предполагается, что ОК являются прямыми потомками гипотенциальных ранних гепатоцитов и что они существуют во «взрослой» печени в составе канальцев Геринга – мельчайших «истоков» желчных протоков. В этом положении они являются стволовой клеткой печени, способной дифференцироваться в направлении гепатоцита и эпителия желчных протоков [36, 62]. Их массивная пролиферация наступает тогда, когда повреждены и дегенерируют зрелые гепатоциты. Это происходит при действии большинства канцерогенов и гепатотоксинов. В этих случаях массивная пролиферация ОК начинается в районе портального тракта, после чего они как бы внедряются в глубь дольки. Эта волна пролиферации завершается новообразованием гепатоцитов и построением новых желчных протоков. Волна АФП совпадает с волной появления ОК, причем АФП может быть обнаружен в некоторой части популяции ОК [82, 89]. Такая частичная вовлеченность популяции АК в продукцию АФП является одним из косвенных указаний на гетерогенность этой популяции, содержащей скорее всего предшественники гепатоцитов и предшественники эпителия желчных протоков, находящиеся на разных стадиях начальной дифференцировки. Следует также отметить, что ОК ведут себя различно в разных системах. Так, у «высокоиндуцибельных» по АФП мышей BAlB/cJ, отравленных четыреххлористым углеродом, типичные ОК легко выявляются окраской на АФП с последующим иммуноэлектронно-микроскопическим анализом. АФП определяется во всех ОК, морфологически неотличимых от «классических» ОК в «канцерогенной» печени крыс [19, 33]. Противоположные результаты были получены в иной системе – при действии сильного алкилирующего агента канцерогенного вещества дипина. Введение дипина с последующей гепатэктомией вело к массивной дегенерации зрелых гепатоцитов, столь же массивной овально-клеточной пролиферации с новообразованием гепатоцитов [5]. Существенного подъема уровня АФП не наблюдалось, так же как не наблюдалось «АФП-положительных» ОК [10].
Появление ОК-подобных клеток при патологии печени человека не описано. Возможная их роль в качестве предшественника опухолей печени также неизвестна. Имеются некоторые косвенные данные в пользу такой возможности [23, 83]. Однако типичные ГЦР и ГБ человека четко отличаются от ОК. Может быть, мышиная ГБ возникла из ОК, но почему она всегда отрицательна по АФП?
Вероятно, возникновение и судьба ОК и их отношение к канцерогенезу станут понятными, когда будут получены, проклонированы и выведены в линии их стабильные клеточные культуры.
Гепатоцеллюлярная карцинома. Проблема продукции АФП ГЦР наименее понятна. Скорее всего здесь существует несколько причин, соответствующих различным ситуациям возобновления его синтеза при неопухолевой патологии.
Бесспорных корреляций между синтезом АФП с определенным гистологическим типом опухоли не выявлено. Обнаружена некоторая зависимость синтеза от уровня дифференцировки опухоли. Так, высокодифференцированные карциномы, как правило, не содержат АФП. Анапластические ГЦР также имеют тенденцию к снижению частоты АФП-положительных случаев. Наибольшая частота и наивысшие уровни АФП отмечены при умеренно дифференцированных ГЦР [63]. Эта закономерность неоднократно установлена для опухолей животных и человека, но ничего более специфичного не найдено.
Низкая продукция АФП высокодифференцированными ГЦР не является неожиданностью. Здесь может действовать тот же механизм подавления экспрессии его гена, что и во «взрослой» печени. Более того, хирургическое повреждение высокодифференцированного опухолевого «АФП-отрицательного» узелка ведет к реэкспрессии АФП в клетках, окружающих зону некроза – воспаления [84]. Можно заключить, что в высокодифференцированных опухолях действует тот же механизм, что и в нормальной «взрослой» печени, и в нем оперируют те же положительные и отрицательные трансфакторы.
Что можно сказать об АФП-продуцирующих опухолях? Очевидно, что большинство из них содержит частичный или полный набор печеночно-специфических положительных трансфакторов, определяющих экспрессию АФП в ГЦР, вместе с другими сывороточными белками. Очевидно, именно поэтому ГЦР ассоциированы с АФП.
Безусловно, должны быть и другие параллели между регуляцией АФП в нормальной печени и в ГЦР. Нет сомнений, что межклеточные или матрикс-клеточные взаимодействия являются теми «нормальными» факторами, которые участвуют в регуляции АФП и в умеренно дифференцированных гепатомах. Ничего более определенного, к сожалению, сказать нельзя.
Было бы интересно эксплантировать в культуру суспензию АФП-отрицательных опухолевых клеток, диссоциированных коллагеназой, чтобы посмотреть, станет ли она вырабатывать АФП наподобие нормальной печени.
Весьма вероятно также, что факторы, определяющие синтез АФП в опухолях, случайно утрачивают продукцию трансфактора, подавляющего транскрипцию гена АФП.
Причиной реэкспрессии АФП может быть и выпадение гипотетического рецептора, участвующего в межклеточных и матрикс-клеточных взаимодействиях.
Интересное наблюдение было сделано на низкодиффиренцированной гепатоме MRH 7777, поддерживаемой in vitro и активно продуцирующей АФП. Практически все гепатомные клетки синтезируют АФП. Однако из нее были получены «оппозитные» клоны, состоящие из 100% «АФП-положительных» и 100% «АФП-отрицательных» клонов [8]. Каких-либо биологических различий между клонами не отмечено. Наиболее интересной особенностью этих клонов была необычно высокая «переключаемость» составляющих их клеток на противоположный по экспрессии АФП тип, достигающая частоты 1:100. Очевидно, что контроль синтеза АФП в этой системе осуществляется на эпигенетическом уровне [8].
Суммируя приведенные выше данные и соображения, можно заключить, что имеются различные пути, приводящие к реэкспрессии АФП в опухолях печени: контроль синтеза АФП в высокодифференцированных и, возможно, в части умеренно дифференцированных гепатом, осуществляемый на основе межклеточных и матрикс-клеточных взаимодействий, утрата определенных звеньев этого контроля (гипотетических рецепторов), случайное выпадение «негативных» трансфакторов, оперирующих в транскрипции АФП гена, и нарушения в эпигенетическом контроле синтеза АФП. Очевидно, что вопрос нуждается в дальнейшем изучении.
В противоположность причинам реэкспрессии АФП в ГЦР клинические аспекты проблемы изучены практически исчерпывающе [16, 96].
«АФП+» при ГЦР встречается приблизительно в 75–80 % случаев при нормальном фоне 40–50 нг/мл. Эта частота существенно выше у детей (до 90%) или юношей (79%) по сравнению со взрослыми пациентами (66%) [37]. Наиболее вероятно, что это связано с преобладанием у юных пациентов носительства вируса гепатита В по сравнению со взрослыми, у которых ГЦР чаще сопровождает цирроз [37].
Некоторые колебания процента «АФП+» случаев при ГЦР отмечены в разных районах мира – частота минимальна в странах Северной Америки и Западной Европы и максимальна в районах, «эндемичных» по ГЦР – Южной и Западной Африке и Юго-Восточной Азии [16]. Эти различия также определяются скорее всего резко различным возрастом пациентов с ГЦР в «эндемичных» районах и районах с низкой частотой ГЦР.
Мониторинг лечения ГЦР по уровням АФП в крови приобретает все большее значение по мере прогресса в области хирургического (пересадка печени) и химио-терапевтического (локальная перфузия печени) лечения этой ранее почти неизлечимой опухоли. Главная трудность в диагностике ГЦР по АФП – перекрывание ГЦР и циррозов печени при уровне АФП 50–500 нг/мл. В этом случае необходимы повторные исследования, выявляющие волнообразную динамику при циррозах и постоянный рост при ГЦР [57].
Другой путь для дифференцировки ГЦР и циррозов по АФП – исследование профиля взаимодействия АФП с лектинами, особенно с лектином из Lens culinaris. Форма АФП, характерная для ГЦР, содержит лишь малую фракцию, реагирующую с указанным лектином, а АФП циррозного происхождения связывается с ним почти полностью [29, 86]. Различный профиль связывания с лектином имеет АФП при ГЦР и метастазах опухолей желудочно-кишечного тракта в печень.
Коммерческий набор для определения лектин-связывающего профиля АФП начали выпускать в Японии [67].
Ранняя диагностика ГЦР
Частота ГЦР резко превышает среднюю для некоторых районов Африки и Юго-Восточной Азии. Это связано с носительством вируса гепатита В и действием потенциального гепатоканцерогена – афлатоксина В.
Определение АФП в группах высокого риска по ГЦР в Китае, Японии, Тайване, Индонезии и на Аляске четко показало перспективность применения этого теста, особенно в сочетании с определением HBs-Ag для раннего выявления ГЦР. Так, например, наличие HBS-Ag в группе носителей повышало риск ГЦР в этой группе в 100 раз по сравнению со средней частотой ГЦР в данной популяции. Определение АФП в этой группе еще более резко повышало вероятность ГЦР – около трети «HBS-Ag-+» – «АФП+» обследованных имели ГЦР в клинически не проявлявшейся операбельной форме [64]. Эффективность по 5- и даже 10-летней выживаемости была установлена при размере выявленной по АФП опухоли менее 5 или 2 см.
Таким образом, АФП-тест обеспечивает даже раннюю диагностику ГЦР в группе высокого риска, сформированной по другим признакам, например, по HBS-Ag и воздействию афлатоксина В.
Пренатальная диагностика врожденной патологии
АФП-тест широко используется для пренатальной диагностики многих врожденных уродств, в первую очередь пороков развития нервной трубки (анэнцефалия и spina bifida). Частота этих уродств чрезвычайно высока и встречается приблизительно в 1% всех нормальных родов.
Это направление выделилось теперь в отдельную область со своей спецификой и читатель может ознакомиться с ней по детальной сводке [2].
В самые последние годы АФП-тест стали применять и для формирования группы высокого риска по болезни Дауна [73].
ЛИТЕРАТУРА
Глейберман А. С. // Бюл. экспер. биол.– 1981.– Т. 93, № 1. – С. 55–58.
Дубинина М. Г. // Итоги науки и техники. Сер. Генетика человека. – М., 1990. – Т. 7. – С. 119–169.
Куприна Н. И., Шипова Н. Я., Харьковская Н. А., Свинолупова С. // Биол. мембраны. – 1990. – Т. 7, № 2. – С. 163–176.
Полторанина В. С. // Бюл. экспер. биол. – 1981. –: Т. 91. – С. 212–215.
Бадаева С, Фактор В. М. // Там же. – 1990. – Т. 109, С. 514–517.
6.
Татаринов Ю. С. // Всесоюзный биохимический конгресс, 1-й: Тезисы. – 1963. – Т. 2. – С. 59.
Шипова Л. Я. Локализация альфа-фетопротеина в онтогенезе крыс и мышей: Дис. канд. биол. наук. – М., 1977.
Эрайзер Т. Л., Эльгорт Д. А., Абелев Г. И. // Бюл. экспер. биол. – 1977. – Т. 83. – С. 711–713.
Abelev G. I. // Acta Un. int. Cancer. – 1963. – Vol. 19. – P. 80–82.
Abelev G., Assecrirova I., Kraevsky N. et al. // Int. J. Cancer. – 1967. – Vol. 11. – P. 551–558.
Abelev G. // Cancer Res. – 1968. – Vol. 28. – P. 1344–1350.
Abelev G. // Advanc. Cancer Res. – 1971. Vol. 14. p. 295–358.
Abelev G. // Transplant. Rev. – 1974. – Vol. 20. – P. 3–37.
Abelev G. I. // Cell Differentiation and Neoplasia / Ed. G. Saunders.– New York, 1978.– P. 257–269.
Abelev G. // Sov. Sci. Rev. Sect. D. – 1980. – Vol. 1. – P. 371–397.
Abelev G., Elgort D. // Cancer Medicine / Eds J. Holland, E. Frei. – Philadelphia, 1982. – P. 1089–1099.
Aoyagi Y., Suzuki Y., Igarashi K. et al. // Cancer (Philad.). – 1991. – Vol. 67. – P. 2390–2394.
Attardi В., Ruoslahti E. // Nature.– 1976.–Vol. 263.– P. 685–687..
Baranov V, Engelhardt N. // Sov. med. Rev. Ser. F.: Oncology (Lond.). – 1987.–Vol. 1. – P. 119–163.
Abelev G. // Tumor Biol. – 1989. – Vol. 10, N 2. – P. 63–74.
Belanger L., Belanger M., Larochelle I. // Nouv. Presse med. – 1972. – Vol. 1. – P. 1503.
Bergstrand C., Czar B. // Scand. J. clin. Lab. Invest. – 1957. – Vol. 9. – P. 277–286.
Braun L., Mihumo R., Faosto N. // Cancer Res. – 1989. – Vol. 49. – P. 1554–1561.
Braunstein G. // Herberman R., McIntire K. Immunodiagnosis of Cancer. – New York. 1979. – P. 383–408.
Breborowicz J., Makiewicz A. // Electrophoresis. – 1989. – Vol. 10. – P. 568–573.
Damjanov I. // Cancer Surv. – 1990. – Vol. 9, N 2. – P. 303–319.
De Nechaud В., Viron A., Puvion E. // С R. Acad. Sci. (Paris). – 1979. – Vol. 289. – P. 737–740.
Dmitrovsky E., Bost G., Chaganti R. // Cancer Surv. – 1990. – Vol. 9, N 2. – P. 369–386.
Du M.-G., Hutchinson W., Johnson Ph., Williams R. // Cancer (Philad.). – 1990. – Vol. 67. – P. 476–480.
Dziadek M. // J. Embryol. exp. Morph. – 1978. – Vol. 46. – P. 135–146.
Dziadek M. // Ibid. – 1979. – Vol. 53. – P. 367–379.
Engelhardt N.. Poltoranina V., Yazova А. // Int. J. Cancer. – 1973. –Vol. 11. – P. 448–459.
Engelhardt N.. Baranov V., Lazareva M. et al. // Histochemistry. – 1984. – Vol. 80. – P. 401–407.
Engelhardt N., Factor V., Yazova A. et al. // Differentiation. – 1990. – Vol. 45. – P. 29–37.
Eraiser Т., Khamzina L. // Int. J. Cancer. – 1988. – Vol. 42. – P. 633–637.
Evarts R., Nagy P.. Nakatsukasa H. et al. // Cancer Res. – 1989. – Vol. 49. – P. 1541 – 1547.
Faruta Т., Kanematsu Т., Matsumata T. et al. // Cancer (Philad.). – 1990. – Vol. 66. – P. 2395–2398.
Freeman A., Engvall E„ Hirata K. et al. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. – 1981. – Vol. 78, N 6. – P. 3659– 3663.
Gibbs P., Zielinski R., Boyd C, Dugaiczyk A. // Biochemistry. – 1987. – Vol. 26. – P. 1332–1343.
Gitlin D., Boesman M. // J. clin. Invest. – 1967. – Vol. 46. – P. 1010–1016.
Gitlin D., Pericelli A., Gitlin G. //Cancer Res. – 1972. – Vol. 32. – P. 979–982.
Gleiberman A., Abelev G. // Int. Rev. Cytol. – 1985. – Vol. 95. – P. 229–266.
Gleiberman A., Kudrjavtseva E., Sharovskaya Yu., Abelev G. I. // Molec. biol. Med. – 1989. – Vol. 6. – P. 95–107.
Gleiberman A., Sharovskaya Yu., Chailakhjan L. // Exp. Cell Res. – 1989. – Vol. 184. – P. 228–234.
Godbout R„ Ingram R., Tilgham Sh. // Molec. cell. Biol. – 1988. – Vol. 8, N 3. – P. 1169–1178.
Greenberg F., Rose E., Alpert E. // Gastroenterology. – 1990. – Vol. 98, – P. 1083–1085.
Hammer R., Krumlauf R., Camper S. et al. // Science,– 1987. –Vol. 225. – P. 53–58.
48.
Hsia J., Wong L., Trimble C., Deutch H. // Biological Activities of Alpha-Fetoprotein / Eds G. Mizejewski, H. Jacobson. – 1987. – Vol. 1. – P. 205–211.
49.
Ishak K., Glunz P. // Cancer. – 1967. – Vol. 20. – P. 396.
50.
Jacobson H., Bennet J., Mizejewski G. // Cancer Res. – 1990. – Vol. 50. – P. 415–420.
51.
Kasai M., Watanabe I. // Cancer (Philad.). – 1970. – Vol. 25. – P. 551.
52.
Keller R., Calvanice N., Tomasi T. // Onco-developmental Gene Expression / Eds W. Fishman, S. Sell. – New York, 1976. – P. 287–295.
53.
Kharkovskaya N.. Svinolupova S., Khrustalev S. et al. // Exp; Path.– 1990.– Bd 40.– S. 288–289.
Kitagawa Т., Yokochi Г., Sugano H. // Int. J. Cancer. – 1972. – Vol. 10. – P. 368–381.
Kroes R.. Williams G.. Weisburger J.. // Cancer Res. – 1972. – Vol. 32. – P. 1526.
Leffert H., Morgan Y., Sell S. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. – 1978. – Vol. 75. – P. 1834–1838.
Lehmann F.-G. // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1975. – Vol. 259. – P. 196.
Lemice I., Faosto N. // Cancer Res. – 1991. – Vol. 51. – P. 4656–4664.
Lester E., Miller J., Yachnin S. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. – 1976. – Vol. 73. – P. 4645.
Lu C., Changelian P., Unanue E. // J. Immunol. – 1984. – Vol. 132. – P. 1722.
Lu C. Wong L., Hsia I. // Biological Activities of Alpha-Fetoprotein / Eds G. Mizejewski, H. Jacobson. – 1989. – Vol. 2. – P. 199–213.
Marceau N.. Jose-Blouin M., Germain L., Noel M. // In vitro. – 1989. – Vol. 25, N4. – P. 336–341.
Masseyeff R. // Path.-Biol.– 1972. – Vol. 20. – P. 703– 727.
McMahon В., London Th. // J. nat. Cancer Inst. – 1991.–Vol. 83, N 13. – P. 916–920.
Mohanty M., Das P., Mittal A., Nayak N. // Int. J. Cancer. – 1978. – Vol. 22. – P. 181 – 188.
Morindga Т., Sakai M., Wegmann Т., Tamaoki T. // Proc. nat. Acad, Sci. USA. – 1983. – Vol. 80.–P. 4604.
Моrо R. // Biological Activities of Alpha-Fetoprotein / Eds G. Mizejewski, H. Jacobson. – 1989. –Vol. 2. – P. 119–128.
Murgita R., Tomasi T. // J. exp. Med. – 1975. – Vol. 141. – P. 269–286.
Murgita R., Tomasi T. // Ibid. – P. 440.
Nahon J. L. // Biochimie. – 1987. – Vol. 69. – P. 445– 459.
Naval J., Villacampa M.-I., Goguel A.-F., Uriel 1. // Biological Activities of Alpha-Fetoprotein / Eds G. Mizejewski, H. Jacobson. – 1987. – Vol. 1. – P. 189–203.
Nishi Sh., Nishita Т., Ohkawa. K. // Tumor Biol. – 1991. – Vol. 12. – P. 184–188.
Nunez E., Benassayag C, Crysteff N. et al. // Biological Activities of Alpha-Fetoprotein / Eds G. Mizejewski, H. Jacobson. – 1987. – Vol. 1. – P. 3–16.
Olsson M., Lindahl G. et al. // J. exp. Med. – 1977. – Vol. 145. – P. 819–827.
Papaconstantinou I., Rabese J., Zhang D.-E. // Develop., Growth, Differ. – 990. – Vol. 32, N 2. – P. 205–216.
Parmelee M.. Hsu H. // Fed. Proc – 1973. – Vol. 32. – P. 979.
Parmelee D., Evenson M., Deutsch H. // J. biol. Chem. – 1978. – Vol. 253. – P. 2114.
Pera M., Roach Sh., Eliss C. // Cancer Surv. – 1990. – Vol. 9, N 2.– P. 243–262.
Rogers M., Watkins S., Gudas L. // J. Cell Biol.– 1990.–Vol. 110.– P. 1767–1777.
Ruoslahti E., Seppala M. // Advanc. Cancer Res.– 1979. – Vol. 29. – P. 275–346.
Sell S. // Cancer Res. – 1978. – Vol. 38. – P. 3107–3113.
Sell S., Hunt I., Knoll В., Dunsford H. // Advanc. Cancer Res. – 1987. – Vol. 48. – P. 37–111.
Shipoua L., Gleiberman А. // Int. J. Cancer. – 1985. – Vol. 35. – P. 135–138.
Sirica A., Richards W., Tsukada Y. et al. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. – 1979. – Vol. 76. – P. 283–287.
Smith C, Kelleher Ph. // Biochim. biophys. Acta. – 1980. – Vol. 605. – P. 1
Smith C, Kelleher Ph. // Biological Activities of Alpha-Fetoprotein / Eds G. Mizejeweski, H. Jacobson. – 1989. – Vol. 2. – P. 35–43.
Taketa K. // Hepatology. – 1990. – Vol. 12, N 6. – P. 1420–1432.
Tchipysheva Т., Guelstein V., Bannikov G. // Int. J. Cancer. – 1977. – Vol. 20. – P. 388–393.
Teilum O. // Acta path. microbiol. scand. – 1965. – Vol. 64. – P. 407–429.
Toki A., Todani Т.; Watanabe Y. et al. // Z. Kinder-chir. – 1990. – Bd 44. – S. 246–248.
Tyner A., Godbout R., Compton R., Tilghman Sh. // J. Cell Biol. – 1990. – Vol. 110, N 4. – P. 915–927.
Uriel J. // J. nucl. Med. – 1989. – Vol. 33. – Suppl. 3. – P. 12–17.
Vogt Th., Solter D., Tilghman Sh. // Science. – 1987.– Vol. 236. – P. 301–303.
Waldman Т., Mclntire R. // Lancet. – 1972. – Vol. 2. – P. 1112.
Waldman Т., Mctnture K. // Immunodiagnosis of Cancer / Eds R. Herberman, K. Mclntire. – New York, 1979. – Vol. 1.– P. 130–146.
Wan Y.-J., Chou J. // Arch. Biochem. – 1989. – Vol. 270. – P. 267–276.
Watabe H. // Cancer Res. – 1971. – Vol. 31. – P. 1192.
Zhang D.-E., Hoyt P. R., Papaconstantineou J. // J. biol. Chem. – 1989. – Vol. 265. – P. 3382 –339.