Судьба органоспецифических антигенов в опухолях первоначально не входила в круг вопросов, стоящих перед нами. Казалось, что эти антигены не имеют отношения к антигенам, специфичным для опухолей или к каким-либо другим проблемам, представляющим онкологический интерес. Но эти антигены, как бы, сами вошли в исследуемый круг вопросов и со временем приобретали все более и более общий интерес как для понимания природы опухолей, так и с практической, прикладной точки зрения.
Органоспецифические антигены мышиной печени были первыми антигенами, которые мы обнаружили иммунодиффузионным анализом. Таких антигенов было выявлено несколько и они локализовались, главным образом, во фракции цитоплазматических гранул (Абелев и др., 1959). Один из этих антигенов, АО – антиген органной специфичности, был изучен наиболее подробно. К нему была вначале получена тест-система на основе истощенной противопеченочной сыворотки, позволившая идентифицировать АО в разных препаратах и показать его утрату перевиваемой гепатомой (Абелев и др. 1959). Этот антиген был довольно прочно связан с фракцией цитоплазматических гранул, но переходил в р-р при воздействии детергента, дезоксихолата Na (ДХ). Повторное растворение в ДХ и осаждение ультрацентрифугированием позволило освободить АО от большинства растворимых белков, а зональный электрофорез в градиенте плотности сахарозы отделил АО от основной сопутствующей липопротеидной фракции цитоплазматических гранул (Абелев и др., 1960). Первый элюат специфических антител был получен именно к АО (Абелев и Авенирова, 1960), и именно для этого антигена была впервые абсолютно точно показана его утрата в перевиваемой гепатоме штамма XXIIа. АО создал стандарт для исследования органо– и опухолеспецифических антигенов. К этому времени проблема антигенного упрощения в опухолях была весьма противоречивой. Данные Вайлера (Weiler, 1952), впервые описавшего этот феномен и подтвержденные Нейрном (Nairn) в 1960 г., находились в противоречии с работами Ферсa и Кабатa (Furth & Kabat), 1941; Дьюлани (Dulanеy), 1949; Мальмгренa (Malmgren), 1950; 1951 гг., которые не находили подобных изменений в опухолях. В.И. Гельштейн, методом анафилаксии с десенсибилизацией обнаружила частичное сохранение органоспецифических антигенов в опухолях печени (В.И. Гельштейн, 1958 г.).
Стало очевидно, что для решения этой проблемы необходимо было выявить как можно более полный спектр органоспецифических антигенов печени и провести количественный анализ антигенного упрощения в гепатомах на уровне индивидуальных антигенов.
В печени выявилось целое семейство специфических для нее антигенов, включающее по крайней мере 7 представителей, четко демонстрируемых иммуноэлектрофорезом (Abelev et al., 1962). Используя частично очищенные электрофорезом в геле антигены в сочетании с поливалентной тканеспецифической сывороткой, нам удалось получить элюаты антител ко всем 7 органоспецифическим антигенам печени (Khramkova, Abelev, 1963).
С помощью тест-систем к 5 печеночным антигенам, мы предприняли систематический анализ гепатом – первичных и перевиваемых на предмет антигенного упрощения. И здесь открылась весьма неожиданная картина, Сначала АО, четко отсутствующий в перевиваемой гепатоме XXIIа, оказался практически на неизмененном по сравнению с печенью уровне в первичных гепатомах и в медленно- растущей перевиваемой гепатоме (Абелев и др., 1963б, Khramkova & Guelstein, 1965). Затем сходная картина вырисовалась и для других печеночных антигенов. Утрата даже одного из 7 была редким явлением в первичных гепатомах, – она возникала при перевивке в процессе прогрессии опухоли, редко приводя к отсутствию большинства, но никогда – к утрате всех антигенов (Khramkova et al., 1963; 1965). Следует подчеркнуть, что при изучении антигенного упрощения мы уже хорошо представляли себе возможность «упрощения» за счет развития опухоли не из тех клеток, в которых локализовались органоспецифические антигены. Поэтому в этой работе мы стремились убедиться, и убедились, что по крайней мере 4 из 7 органоспецифических антигенов печени локализовались в гепатоцитах (Энгельгардт, 1963; Engelhardt et al., 1963). Органоспецифические антигены локализовались в цитоплазме гепатоцитов, что соответствовало представлениям и том, что дифференцировка клеток проявляется в строении и функциях цитоплазмы. Однако, при регенерации печени после частичной гепатэктомии два антигена полностью перемещались в ядро (Хибовский и др., 1968). Повидимому, здесь мы впервые встретились с перемещением тканеспецифических трансфакторов из цитоплазмы в ядро, но еще не настало время ни для трансфакторов, ни для их внутриклеточной миграции. В результате этого исследования мы смогли сделать следующие выводы (Abelev, 1965; Куприна (Храмкова), 1965):
а) Органоспецифические антигены никогда полностью не утрачиваются в гепатомах – «отпечаток» органа, где возникла опухоль всегда в ней остается;
б) Утрата органоспецифических антигенов происходит скачкообразно в процессе первой перевивки, а затем, как правило, антигенный спектр остается постоянным. Дальнейшая утрата антигенов происходит более редко и затрагивает разные антигены в индивидуальных штаммах гепатом.
в) Набор органоспецифических антигенов, сохраняющихся в разных опухолях и на разных стадиях прогрессии, строго индивидуален;
г) Наиболее злокачественные опухоли с высокой скоростью роста утрачивают максимальное количество органоспецифических антигенов параллельно с увеличением в них АФП.
И отсюда мы заключили, что уникальная для каждой индивидуальной опухоли антигенная структура является отражением уникального пути канцерогенеза и прогрессии для индивидуальных канцерогенных опухолей в отличие от сходства и единообразия антигенной структуры вирусных опухолей (Абелев, 1965; Abelev, 1965).
Дальнейшее изучение тканеспецифических антигенов печени шло по линии гепатоцитарных маркеров, как характерных признаков структуры печеночной балки. Это был важный аспект в исследовании «структурной репрессии» АФП.
Выявление гепатоцитарных маркеров началось с антигенов клеточной мембраны. Л.А.Зильбер был убежден, одно время, что специфические опухолевые антигены следует искать в первую очередь на клеточной мембране. Чтобы выявить антигены клеточных мембран, мы воспользовались методом Houghton'a, который последовательной экстракцией клеток р-рами NaCl возрастающей молярности – от 0,14 до 1М удалял из клетки все растворимые белки, оставляя так называемые клеточные «тени» (cell ghosts) – липопротеидный скелет, включающий мембраны эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи и собственно клеточные мембраны. Антисыворотка к «теням» гепатоцитов интенсивно «окрашивала» (непрямым ИФ-методом) клеточную мембрану с ярким утолщением в районе желчного капилляра, а также аппарат Гольджи (Beloshapkina & Abelev, 1965; Белошапкина и Абелев, 1966). Антиген желчного капилляра (АГ I) в дальнейшем удалось выделить, частично очистить и получить к нему антитела (Рудинская, 1967). Он оказался мембранным гликопротеидом желчных капилляров и кутикулы тонкого кишечника (Храмкова и Белошапкина, 1973; Khramkova and Beloshapkina, 1974). Таким образом АГ I имел ограниченную тканевую экспрессию (печень, кишечник) и утрачивался в некоторых гепатомах (Belоshapkina & Khramkova, 1967 а, b; Белошапкина и др., 1979). Когда в середине 80-х мы стали переходить на МкАТ, то одними из первых были получены антитела именно к АГ I (Рудинская и др., 1987) (1). Он был очень точно охарактеризован методом иммуноэлектронной микроскопии как компонент гликокаликса желчного капилляра и кутикулы кишечника (Kuprina et al., 1990). Впоследствии он был идентифицирован как мышиный аналог Bgp – гликопротеида мембраны желчных капилляров, относящегося к семейству раково-эмбрионального антигена (СЕА). Более того, было показано, что АГ I (Bgp) является адгезионной молекулой суперсемейства иммуноглобулинов (Daniels et al., 1996).
Был обнаружен также близкий по локализации антиген – антиген желчных капилляров (АЖК) локализующийся в участках гепатоцитов как бы «подстилающих» район желчного капилляра со стороны цитоплазмы. Он не был идентичен Bgp (Энгельгардт и др., 1991).
Другой антиген – (АГ II) равномерно «окрашивал» поверхность гепатоцита в балке, а антитела к асиалогликопротеиду четко и интенсивно «выкрашивали» базолатеральную поверхность гепатоцита, обращенную в пространство Диссе (Куприна и др.,1990; Энгельгардт и др., 1991). Кроме того были получены антитела, специфически взаимодействующие с купферовскими клетками. Эти МкАТ избирательно «окрашивали» макрофаги и выявляли в них специфический антиген, отсутствующий в моноцитах (Rudinskaya et al., 1992).
В этом же цикле работ был идентифицирован антиген (А6), общий для гепатоцитов и их гипотетических предшественников – овальных клеток (Фактор и др., 1990; Engelhardt et al., 1993). А6 обнаруживался также в эритробластах эмбриональной печени (Engelhardt et al., 1993). Таким образом, была создана коллекция моноклональных антител, характеризующих гепатоцит в печеночной балке взрослой мыши. Кроме того мембранные антигены, локализованные на разных доменах гепатоцита, явились прекрасными маркерами полярности его плазматической мембраны, наиболее показательного признака дифференцировки эпителиальной клетки. В спонтанных гепатомах мышей, в зависимости от степени их дифференцировки, полярность распределения антигенов сохранялась или утрачивалась. Наиболее чувствительным оказался АГ I (Bgр), который исчезал даже в некоторых высокодифференцированных опухолях (Шипова и Куприна, 1984; Куприна и др., 1990). При этом, другой антиген желчного капилляра (АЖК) – сoхранялся (Шипова, Kуприна, неопубл.данные). Таким образом, АГ I оказался великолепным маркером зрелого гепатоцита. Его присутствие и полярное распределение в районе желчного капилляра свидетельствует о зрелости и целостности структуры печеночной балки (Глейберман и др., 1979; Глейберман, 1980; Gleiberman & Abelev, 1985).
Антитела к мембранным антигенам вместе с антителами к АФП позволили охарактеризовать гепатоциты, синтезирующие АФП в печени мышей, регенерирующей после отравления ССl4. С их помощью было показано, что реэкспрессия АФП имеет место в перинекротических гепатоцитах, выходящих из структуры печеночной балки (Gleiberman et al., 1983). Более того, эти антитела четко выявляли in vitro балкоподобные структуры, в которых был супрессирован синтез АФП (Gleiberman et al., 1989 а, b). Эти балки строились изолированными гепатоцитами, заключенными в трехмерный коллагеновый матрикс в культуре (cм. «Альфа-фетопротеин – биология»).
Таким образом, антигены мембраны гепатоцитов оказались бесценными маркерами, определяющими отношения гепатоцитов между собой, их отношения к печеночной балке и степень созревания печеночной клетки.
Другой аспект проблемы органоспецифических антигенов – их сохранение в большей или меньшей степени в опухолях, – как вначале это было показано для гепатом, а потом и для других опухолей. Как-то я обсуждал эту проблему с сотрудником лаборатории Зильбера Виктором Тер- Григоровым и он высказал мысль, что эту особенность опухолей можно использовать для определения неизвестного первичного очага опухоли по ее метастазу. Мне эта мысль запала в голову и, вскоре, эта идея была положена в основу кандидатской диссертации Э.Р. Карамовой, посвященной органоспецифическим антигенам рака молочных желез (РМЖ) человека. Это была очень трудная работа – сбор человеческого материала по клиникам и моргам, экстракция антигенов из молочных желез и из их опухолей, потребовавшая специального, очень мощного гомогенизатора, получение антисывороток к этому материалу и т.п. Но Карамова с этой работой справилась и получила хорошие органоспецифические антисыворотки к молочной железе человека. Сыворотки выявляли в иммунодиффузии один антиген. Карамова показала, что соответствующий антиген сохраняется ~ в 75% исследованных опухолей и примерно в половине их метастазов (Карамова, 1967; 1968; 1970). Но определение неизвестного первичного очага опухоли потребовало бы коллекции антисывороток к разным тканям – потенциальным источникам опухоли. Это было мало реально и работа дальнейшего развития у нас, к сожалению, не получила. Думаю (сейчас), что напрасно, т.к. иммуногистохимическое исследование микрометастазов РМЖ в лимфатических узлах имело бы клинический смысл – и не малый.
* * *
Рассматривая этот раздел нашей работы с позиций того, что они дали для понимания общих проблем иммунологии рака, мы склонны полагать, что они способствовали возникновению дифференцировочного аспекта в иммуноонкологии.
Иммунодиагностика сегодня полностью строится на дифференцировочных антигенах не только при гемобластозах, но и при карциномах. Причем в группу дифференцировочных антигенов входят помимо антигенов дефинитивных тканей и онко-фетальные антигены, такие как АФП, РЭА, СА125, АГЭБ (2) и другие. Именно к дифференцировочным антигенам относятся опухолевые маркеры (Абелев, 1982 а,б; Abelev & Sell, 1999). В области же иммунофенотипирования гемобластозов, вся диагностика строится на тончайшем определении дифференцировочных антигенов, строго сохраняющихся в соответствующих неоплазиях. Можно думать, что злокачественная трансформация при гемобластозах опирается на механизмы дифференцировки соответствующих клеточных линий (Abelev & Sell, 1999; Абелев, 2000 а).
Интересно, что возникающий иммунный ответ на невирусные опухоли человека и животных, как правило, также опирается на дифференцировочные антигены с орто- или экзотопической экспрессией (см. Абелев, 2000 г).
Наши работы были среди первых, четко показавших по крайней мере частичное сохранение опухолями ткане- или клеточно-специфических антигенов взрослого и эмбрионольного типа.
Примечания
(1) Т.Д. Рудинская – до замужества Белошапкина. Назад
(2) АГЭБ – антиген эритробластозов (см. раздел о лейкозах). Назад