Параллельно с исследованиями по гепатомам, начатыми нашей группой на основе иммунодиффузии, проводились работы на классических объектах лаборатории Зильбера – вирусных опухолях: куриной саркоме Рауса, раке молочных желез мышей и вирусных лейкозах мышей. При этом мы старались перенести на эти объекты методы иммунодиффузии, более чем оправдавшие себя в работе с гепатомами.
Представления тогда об антигенах вирусных опухолей базировались на предшествовавших классических исследованиях Кидда, Шоупа и Рауса (Kidd, Shope, Rous) на вирусной папилломе и карциноме кроликов (папиллома и карцинома Шоупа). Для этих опухолей в реакции связывания комплемента было показано существование вирусного и растворимого (клеточного?) антигенов, отличных друг от друга. Предполагалось также, что клеточный антиген мог вызывать иммунитет к перевиваемой карциноме Шоупа. И это все, что было известно об антигенах вирусных опухолей (см. Зильбер и Абелев, 1962).
Первой задачей для вирусных опухолей в нашей работе была идентификация вирусного и клеточного антигенов в иммунодиффузии.
В разгар работ по иммунодиффузии, когда наша группа занималась раком печени, А.И. Гусев приступил к саркоме Рауса, а О.М. Лежнева к раку молочных желез мышей (РМЖ). Эти системы были впервые подвергнуты иммунодиффузионному анализу с весьма четкими результатами. В обеих вирусных опухолях был обнаружен растворимый антиген, сопровождающий вирусную инфекцию и служащий маркером присутствия вируса.
Саркома Рауса
А.И. Гусев при иммунодиффузионном анализе экстракта из куриной саркомы Рауса с кроличьей антисывороткой к нему выявил сильную линию преципитации, четко отличную от антигенов нормальной сыворотки мыши и нормальных органов. Он получил элюат моноспецифических антител к этому антигену и показал, что антиген не осаждается ультрацентрифугированием. Биологически активный вирус уходил в осадок, тогда как антиген оставался в надосадочной жидкости. В то же время элюат антител к растворимому антигену не нейтрализовал вирус Рауса, вызвавший опухоль, хотя в сыворотке после удаления этих антител оставались вирус-нейтрализующие антитела (Гусев, 1960 а, б). Раусный антиген не был идентичен специфическому антигену метилхолантреновой саркомы кур, также выявляемому иммунодиффузией (Гусев, 1960 в). Он не обнаруживался также в Раусных саркомах, индуцированных на крысах (Svoboda & Gusev, 1962). Исследования по Раусному антигену составили кандидатскую диссертацию А.И. Гусева (1962). Какова природа этого антигена и как он связан с продукцией вируса оставалось неясным. Был ли он растворимым группоспецифическим антигеном вируса или вирус-индуцированным белком? К сожалению, мы должны отнести эту проблему к числу нерешенных или, скорее, к незаконченным. Но сам этот цикл работ А.И. Гусева, теперь, по прошествии более сорока лет, представляется безупречным по выполнению и по выводам. Его незавершенность – причина того, что эти работы не вошли в современную систему знаний об антигенной структуре саркомы Рауса.
Вирус рака молочных желез мышей
Аналогичная работа параллельно развивалась О.М. Лежневой на модели рака молочных желез мышей (РМЖ). И в этой системе иммунодиффузия позволила идентифицировать с помощью гетерологической крысиной гипериммунной сыворотки* (1) сильный преципитирующий антиген в экстракте лактирующей молочной железы, содержащей вирус РМЖ (ВРМЖ). Антиген был четко отличным от антигенов лактирующей молочной железы (МЖ) безвирусных линий. Антиген не осаждался ультрацентрифугированием при 100.000 g. Он отсутствовал в экстракте молочной железы высокораковых линий, полученных кесаревым сечением и вскормленных молоком низкораковых мышей. Таким образом, иммунодиффузионным анализом был выявлен растворимый антиген, ассоциированный с ВРМЖ (Лежнева, 1961). В начале семидесятых годов аналогичный антиген (со ссылкой на Лежневу) был описан Parks'ом (США), который предложил использовать антиген в качестве «маркера» ВРМЖ, поскольку биологический тест на ВРМЖ очень длителен и неточен.
Несколько лет спустя Э.Р. Карамова, пытаясь получить кроличью антисыворотку к тканеспецифичным антигенам молочной железы мышей, обнаружила иммунодиффузией антиген, характерный для «факторных» МЖ и отсутствующий в экстрактах МЖ «бесфакторых» линий. Обнаруженный антиген не осаждался ультрацентрифугированием при 105.000g и был, повидимому, идентичен антигену, ранее обнаруженному О.М. Лежневой в МЖ факторных мышей. Правда антисыворотки Лежневой были к этому времени утрачены и прямого сравнения, поэтому, не проводилось. Э.Р. Карамова провела прямое сравнение преципитацией в геле своих антител с антителами к группоспецифическому (внутреннему) антигену ВРМЖ, полученными от Новинского (R. Nowinski) из лаборатории Олда и Бойса. Антитела выявляли идентичный антиген (Карамова, 1968 а). Таким образом, эта серия исследований внесла полную ясность в проблему – и Лежневой и Карамовой был выявлен растворимый группоспецифический антиген вируса, синтезируемый в РМЖ в избытке и присутствующий в «факторных» МЖ не только в качестве структурного компонента ВРМЖ, но и в свободном виде. Очевидно, что этот антиген является строго специфическим маркером присутствия вируса. Поскольку он является группоспецифическим, то он представлен во всех вариантах ВРМЖ.
Ясно, что кроличьи антисыворотки к этому антигену могли бы составить большую коммерческую ценность, но в то время эта «коммерциализация» иммунного реагента в нашей стране представлялась нереальной.
Вирусы мышиных лейкозов
По мере того, как мы все более погружались в изучение АФП, Лев Александрович все более усиливал давление на нас с тем, чтобы мы переключались на специфические опухолевые антигены – вплоть до отказа подписывать заявки на мышей для работы с АФП. К г. я отошел от участия в экспериментальной работе по АФП, оставив ее Свете Перовой, а сам с Н.В. Энгельгардт и Е.С. Иевлевой переключился на мышиные вирусные лейкозы* (2). Параллельно О.М. Лежнева начала очень трудную работу по иммунофлуоресцентной (ИФ) идентификации антигенов мышиных сарком. В основу этих работ было положено стремление найти иммунохимические (т.е. «подконтрольные» антителам) подходы к определению и выделению специфических опухолевых антигенов. В большинстве систем антитела не играли роли в контроле над опухолевым ростом, а то и вовсе не образовывались. Вести же иммунохимическую работу под контролем «иммунных лимфоцитов» (даже Т-лимфоциты тогда еще не были открыты) было невозможно. Изучать антигены, на которые реагируют Т-клетки in vitro, очень не просто даже сегодня, т.к. для реакции Т-клеток необходим комплекс МНС-пептид, представленный на мембране живой клетки. Природа этих антигенов стала проясняться в последние годы, когда были идентифицированы гены, кодирующие соответствующие антигены. В то же время лишь в одной системе – мышиных вирусных лейкозах – были найдены цитотоксические антитела, отличающие группу лейкозов Раушера–Френд–Молони и лейкоз Гросса друг от друга, т.е. выявлявшие типоспецифические вирус-индуцированные антигены. Это была классическая работа Old'a и Boyse'a (1964 г.) – положившая начало иммунологии вирусных лейкозов. Другая линия исследований почти не имела аналогов, вернее имела совсем недавний аналог. G. Möller показал, что гипериммунизация мышей сингенной метилхолантреновой опухолью приводит к образованию антител, выявляемых ИФ тестом на живых клетках. О.М. Лежнева (совершенно независимо от Möller'a, т.к. его работа еще не была известна), отважилась на получение и выявление антител к метилхолантреновым саркомам в строго сингенной системе. В случае успеха можно было думать о выделении опухолевых антигенов трансплантационного типа (TSTA) под контролем таких антител.
Итак, в 1965г. мы приступили к работе по обоим направлениям. Вначале мы воспроизвели результаты Олда и Бойса по мышиным цитотоксическим антителам к сингенному лейкозу Раушера и получили такие антитела. Затем отработали нейтрализацию этих антител экстрактом лейкоза Раушера, что было необходимо для испытания фракций при разделении экстракта методом препаративного электрофореза. Отработав нейтрализацию, мы перешли к препаративному разделению экстракта электрофорезом в агарозном геле под контролем нейтрализуюшей активности получаемых фракций. Нельзя сказать, что разделение было очень четким: нейтрализующая активность фракций никогда не достигала 100%, а границы активности не были очень резкими – фракции несколько «размазывались». Тем не менее, пик активности приходился на α-β-глобулиновую фракцию, с подвижностью, приблизительно, гемоглобиновой (Абелев и др. 1968).
Когда мы имели уже эти данные, я выезжал в США на симпозиум по иммунологии опухолей, – с докладом по АФП (Abelev, 1968). Приглашение на симпозиум было от Честера Саутема (Chester Southam), с которым я был хорошо знаком до того благодаря его визиту в отдел Зильбера, а также по противораковому конгрессу (1962) и сухумскому симпозиуму по специфическим опухолевым антигенам (1965). Саутем работал в Sloan-Kettering Cancer Center, и он пригласил меня дать семинар после или до симпозиума в этом институте, где работали также Олд и Бойс. На семинаре я рассказывал об АФП, но упомянул еще о поверхностных антигенах и совсем в двух словах – о мышиных лейкозах. Но после доклада Олд и Бойс пригласили меня в свою лабораторию и попросили рассказать о лейкозной работе. К моему удивлению они живо заинтересовались нашим подходом и результатами, рассказали о недавнем своем обнаружении группоспецифического антигена мышиных лейкозов (ГСА), внутреннего антигена вируса Гросса, и предложили сравнить наш ТСА (типоспецифический антиген) с ГСА. Преципитирующую тест-систему на ГСА они мне дали. Она хорошо работала в иммунодиффузии и мы очень быстро установили, что ГСА и ТСА относятся к разным электрофоретическим фракциям – ГСА имеет подвижность γ-глобулина, а ТСА – α2- β (Hb) и не давали друг с другом перекрестных реакий (Энгельгардт и др., 1969).
При иммунофлуоресцентном исследовании лейкозов совершенно неожиданно оказалось, что ГСА четко выявляется на мембране лейкемических клеток (Энгельгардт и др. 1969; 1970). Ранее предполагалось, что собственно вирусные антигены, входящие в состав вирусной мембраны, могут имитировать типоспецифические антигены лейкозных клеток при почковании с клеточной мембраны. Этим вопросом у нас занимался Коля Дорфман, бывший дипломник, а затем ассистент кафедры вирусологии, где я работал по совместительству. Коля наладил метку антител ферритином ––тогда в ходу была именно такая метка для иммуноэлектронной микроскопии. Он показал, что ТСА лейкоза Раушера локализуется на мембране не только в составе вируса, но и независимо от почкующегося вируса и может, следовательно, выступать как клеточный ТСА (Дорфман 1971, 1972, Dorfman et al., 1972). Так что мы, хотя и были удивлены, но все же были подготовлены к мембранной локализации ГСA. Странным было то, что ГСA – внутренний компонент вирусного «ядра» (core) – был экспрессирован на наружной клеточной мембране. Поскольку ГСA был компонентом всех лейкозных вирусов, в том числе вируса Гросса, имеющего вертикальную передачу, то отсутствие антител к нему у мышей – носителей опухоли – было естественным в силу приобретенной толерантности. Таким образом, складывалось впечатление, что структурные вирусные белки могут экспрессироваться на мембране опухолевой клетки и создавать мозаику вирусных антигенов, с иммунологическим ответом на те антигены, к которым нет толерантности. При этом ГСА экспрессируется на всех лейкозах. В дальнейшем в работе с Дорфманом, Огастом и Стрэнд (Th. August, M.Strand, USA) и О.М. Лежневой мы полностью подтвердили это предположение (Дорфман и др., 1973; Dorfman et al., 1972; Lezneva et al., 1976; Лежнева и Стрэнд, 1979; см. Лежнева и Абелев, 1985). В это же время Novinski в США показал, что полипептиды лейкозных вирусов образуются под контролем полицистронных генов gag- и env и включают (до нарезания) все последовательности отдельных ГСА и ТСА антигенов и целиком экспрессируются на клеточной мембране (см. Лежнева и Абелев, 1985). Так что проблема отношений вирусных и клеточных антигенов в вирусных лейкозах становилась более или менее ясной, в том числе, благодаря и нашим работам по мембранной локализации вирусных антигенов.
Но эта часть работы проводилась позже, а ход ее развития был прерван другим неожиданным открытием.
У нас была крысиная анти-ГСА сыворотка, привезенная от Олда. Мы очень экономно к ней относились и, естественно, старались получить такую антисыворотку сами. Сначала мы проиммунизировали кроликов в лимфоузел специфическим преципитатом анти-ГСA с экстрактом лейкемических клеток, а затем стали истощать антисыворотки экстрактом селезенки мышей. При этом возникло впечатление, что селезенка ослабляет и реакцию анти-ГСA со своим антигеном. Применив концентрированный экстракт селезенки взрослых мышей низкораковой линии, мы смогли увидеть в нем полосу ГСА. Было решено, что мыши нашего вивария широко заражены вирусами мышиного лейкоза и являются его носителями (Иевлева и др. 1969). Но, так как мы исследовали экстракты из нескольких селезенок взрослых мышей, то, чтобы исключить банальное заражение вирусом, необходимо было исследовать индивидуальных мышей высоко- и низкораковых линий и их эмбрионы, которые могли заразиться только при вертикальной передаче вируса с яйцеклеткой или спермой. Такое исследование было проведено радиоиммунодиффузионным методом с Олд'овской и нашей тест-системами на ГСA и были получены вполне однозначные результаты: группоспецифический антиген лейкозных вирусов мышей обнаруживался у всех испытанных индивидуальных мышей как высоко- так и низколейкемических линий и на всех стадиях их развития (Abelev & Elgort, 1970; Абелев и Эльгорт, 1970). Результаты радиоиммунодиффузии были подтверждены иммунофлуоресцентным выявлением ГСА (Lejneva & Abelev, 1970). И тут мы стали перед дилеммой – либо убиквитарный лейкозный вирус, притом с вертикальной передачей, либо нормальный клеточный антиген, перекрестно- реагирующий с ГСA. Мы бы стали исключать вторую возможность, но тут – в тот же год и в тот же месяц (сентябрь 1970) – в PNAS'e появилась статья большой группы Huebner'a* (3) о повсеместном распространении группоспецифического комплемент-связывающего антигена лейкозных вирусов у мышей высоко- и низколейкемических линий. Huebner обратил внимание на обе наши работы, пригласил меня на конференцию по лейкозам в Неаполь, куда меня, конечно, не пустили, но стало ясно, что в наших работах был выявлен антиген эндогенных вирусов С-типа, существование которых становилось все более ясным по вирусологическим исследованиям и предсказаниям гипотезы Хюбнера и Тодаро. Наше наблюдение было первым (1969, 1970) по убиквитарному распространению общего группоспецифического антигена лейкозных вирусов мышей. Открывался мир эндогенных лейкозных вирусов – возникал новый взгляд на природу лейкозов и опухолевых антигенов (см. Зильбер и др. 1976; Abelev, 1973).
Антиген эритробластов (АГЭБ)
При получении кроличьей антисыворотки к ГСА вируса Раушера в этой сыворотке обнаружились антитела к антигену, отличному от ГСА и присутствующему в экстракте лейкозной селезенки и сыворотке лейкозных мышей. Небольшие количества антигена были обнаружены в нормальной сыворотке мышей и несколько бóльшие – в сыворотке новорожденных мышей. Мы легко получили элюат антител к этому антигену и вскоре установили, что антиген является мембранным компонентом эритробластов мыши, почему и был назван АГЭБ – антигеном эритробластов (Иевлева и др., 1974; Иевлева, 1975; Ievleva et al., 1976). Поскольку лейкоз Раушера является эритробластозом, то обнаружение при нем больших количеств эритробластного антигена представлялось вполне естественным. Антитела к АГЭБ красили эритробластные колонии в селезенке облученных мышей и инактивировали эритробласты, а сам АГЭБ не был идентичен гликофорину А, специфическому дифференцировочному антигену эритроидной линии (Мечетнер и др., 1978; 1979; 1981; Иевлева и др., 1979 б; Мечетнер, 1985). В начале 80-х годов к АГЭБ были получены моноклональные антитела (Мечетнер и др., 1983; 1985), которые были использованы для получения иммунотоксина (Tonevitsky et al., 1985) и для удаления клеток эритробластоза из костного мозга мышей с лейкемией Раушера (Tonevitsky et al., 1986 а, б). Очень важным аспектом применения АГЭБ было использование его для определения стволовых клеток эритробластоза Раушера. Они оказались не стволовыми кроветворными клетками, лишенными АГЭБ, а эритробластами, содержащими этот антиген (Мечетнер и др., 1979). Эти данные явились важным доказательством того, что эритробластный лейкоз возникает на основе эритробласта, т.е. коммитированной полустволовой, а не стволовой кроветворной клетки. Вскоре было показано, что АГЭБ дает перекрестные реакции с аналогичным антигеном у человека и следовательно может служить специфическим маркером нормальных и патологических эритробластов в клинике (Иевлева и др., 1978). К человеческому АГЭБ были получены МкАТ (Mechetner et al., 1987) – они нашли применение в иммунофенотипировании острых лейкозов и парциальной красноклеточной аплазии в гематологической клинике (Мечетнер и др., 1987; Тупицин и др., 1987 а,б; Tupitsyn et al., 1989; Идельсон, 1981). АГЭБ оказался также отличным маркером эритробластной дифференцировки и, по нашему предположению, одним из рецепторов трансферрина (см. Фуксон и др. 1999). С этим предположением хорошо согласуется локализация АГЭБ в мембране эмбриональных гепатоцитов и в криптах кишечника, т.е. там, где транспорт железа высоко вероятен (Shipova et al., 1994).
С этим антигеном много работал покойный И.С. Ирлин вместе с Э.Н. Розиновой и Е.Б. Мечетнером. Первоначально мы предполагали использовать АГЭБ для выявления эритробластоза среди острых, морфологически недифференцированных лейкозов человека. Это действительно было возможно, но такие лейкозы встречались очень редко (Иевлева и др., 1986; Tupitsyn et al., 1989).
Гораздо более практичной оказалась диагностика по АГЭБ парциальной красноклеточной аплазии (ПККА). Это гематологическое заболевание развивается на основе эритробластной пролиферации и антиген эритробластов при ПККА представил большую клиническую ценность (Пивник, 1997)* (4). А для иммунофенотипирования лейкозов и идентификации гистиоцитом в клинике применяются наши МкАТ D-11, направленные к человеческому аналогу мышиного макрофагального антигена (Rudinskaya et al. 1992; Tupitsyn et al., 1996; Petrovichev et al., 1997).
Таким образом, и дифференцировочные антигены лейкозов, выявленные в лаборатории, нашли свое экспериментальное и клиническое применение.
Специфические антигены канцерогенных сарком
Как уже упоминалось, параллельные исследования по иммунофлуоресцентному выявлению специфических антигенов в канцерогенных саркомах в 1964–1965 гг. начала проводить О.М. Лежнева. В литературе не было подобных прецедентов, а появившаяся в 1964 г. сходная статья Мeллера (Möller) стала нам известна, когда работа Лежневой была в полном ходу. В ее исследовании были предусмотрены все предосторожности и контроли: для иммунизации были взяты опухоли первых генераций, а от донора опухоли трансплантировалась кожа хвоста на иммунизируемое животное, чтобы исключить малейшие различия в трансплантационных антигенах между опухолью и реципиентом. Гипериммунизация проводилась облученными клетками первичной опухоли. Гипериммунные сыворотки мышей давали иммунофлуоресцентное окрашивание до 80% живых опухолевых клеток В 5 метилхолантреновых (МХ) саркомах были обнаружены антигены с четкой индивидуальной специфичностью, но и со слабыми перекрестными реакциями. Несомненно, что в этих опытах выявлялись TSTA* (5) канцерогенных сарком (Lejneva et al., 1965; Лежнева, 1969; 1970; Zilber et al. 1966).
Вести фракционирование МХ-сарком под контролем мышиных сывороток, имевшихся в мизерном количестве, было нереальным. Как жаль, что в этих опытах мы не проверили перекрестов с лейкозными антигенами! Вполне возможно, что здесь обнаружилось бы неожиданное родство, тем более, что в МХ- опухолях резко увеличивалось количество ГСА, скорее всего из-за экспрессии эндогенных вирусов (Боговский и Лежнева, 1977; 1978).
Таким образом, цикл исследований по лейкозам показал, что:
а) структурные антигены вирусов типа С – как внутренние (ГСА) так и наружные (ТСА) экспрессируются на мембране лейкозных клеток;
б) структурные антигены вируса, экспрессированные на клеточной мембране лейкозных клеток могут выполнять и, по крайней мере, отчасти выполняют роль специфических опухолевых антигенов, активных в сингенной системе;
в) выявление группоспецифического антигена лейкозных вирусов группы С явилось первым иммунологическим доказательством наличия убиквитарных эндогенных лейкозных вирусов группы С;
г) специфические антигены канцерогенных сарком, выявляемые антителами в сингенной системе, могут быть частично представлены антигенами эндогенных вирусов, активированнных в опухоли. Какую роль эти антигены играют в противоопухолевом иммунитете, где участвуют мутировавшие белки и эктопически экспрессирующиеся «cancer-testis» антигены пока неизвестно.
Примечания
(1) Крысы предварительно «толерировались» гомогенатом МЖ безвирусных мышей, но они продолжали образовывать антитела к антигенам нормальных, безфакторных МЖ. Назад
(2) В 1970 г., после написания обзора по АФП в Adv. Cancer Res. я вновь полностью включился в экспериментальную работу по АФП (см. Abelev, 1989а.) Назад
(3) Huebner, Kelloff, Sarma et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1970, 67, 366–376 Назад
(4) А.В. Пивник Аутоиммунные депрессии красного ростка кроветворения: клиника, диагностика, лечение. Дисс. на соискание уч. степ. д-ра мед. наук. М., 1997 Назад
(5) Tumor specific transplantation antigen. Назад